葡萄糖含量試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物，而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物。植物可通過(guò)光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動(dòng)物而言，葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組
織等的WEI一能源，而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。
測(cè)定原理：
葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過(guò)氧化氫；過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在 505 nm 有特征吸收峰。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽和蒸餾水
試劑的組成和配制：
試劑一：0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體 10ml×1 瓶，4℃保存；
試劑三：液體 10ml×1 瓶，4℃保存；
葡萄糖提取：
1、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），研磨成勻漿，冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次后，8000g，25℃離心10min，取上清液備用。
2、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：蒸餾水體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL蒸餾水），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次），95℃水浴10分鐘（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8000g，25℃離心 10min，取上清液備用。
3、其他類(lèi)液體，離心后可直接取上清檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm，蒸餾水調(diào)零。
2、混合試劑的配制：使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合，用多少配多少。
3、加樣表（在EP管或96孔板中加入下列試劑）：
試劑（μL） | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測(cè)定管 |
樣本 |
|
| 20 |
試劑一 |
| 20 |
|
蒸餾水 | 20 |
|
|
混合試劑 | 180 | 180 | 180 |
混勻，置 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25'C（其它物種）保溫 15min 后，于 505nm 波長(zhǎng)處讀取吸光
度?？瞻坠?、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管吸光值分別記為 A1、A2 和 A3?？瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只要做一管。
葡萄糖含量計(jì)算：
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算
葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)
=0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷Cpr。
2、按樣本鮮重計(jì)算
葡萄糖含量（µmol/g 鮮重）= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)
=0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷W
3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
葡萄糖含量（µmol/104cell)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)
=0.001×(A3-A1)÷(A2-A1)
C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5µmol/mL；V1：加入樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1mL；
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。
注意：低檢測(cè)限為 50nmol/g 鮮重或 0.5nmol/mg prot
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：
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