乳酸（LA）含量檢測(cè)試劑盒說明書微量法
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加入0.6ml試劑一充分溶解?？煞盅b后-20℃保存， 避免反復(fù)凍融；
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加入6mL試劑一充分溶解；可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；
試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。 臨用前每瓶加入6mL 試劑一混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；
試劑五：液體3mL×1瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1支，4℃保存。臨用前加入1.04mL提取液配成100µmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
顯色液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑三（V）：試劑四（V）：試劑五（V）=1：1：0.5的比例充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；
產(chǎn)品說明：
乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評(píng)估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時(shí)使NAD+還原生成NADH和H+，H+傳遞給PMS生成的PMSH2還原特異性底物， 在450nm處有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、研缽/勻漿器、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、乙醇和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理：
- 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min后取上清待測(cè)。
b. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（106個(gè)）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃， 12000g離心10min后取上清待測(cè)。
c. 血清（漿）：取100µL血清（漿）加入0.9mL提取液，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。
二、測(cè)定操作
1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長(zhǎng)調(diào)至450nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。
2、標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將100µmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)。
3、加樣表：
| 測(cè)定管 | 對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
樣品（µL） | 10 | 10 | - | - |
標(biāo)準(zhǔn)品（µL） | - | - | 10 | - |
蒸餾水（µL） | - | 10 | - | 10 |
試劑一（µL） | 40 | 40 | 40 | 40 |
試劑二（µL） | 10 | - | 10 | 10 |
工作液（µL） | 140 | 140 | 140 | 140 |
于 37℃準(zhǔn)確反應(yīng) 30min。于 450nm 處測(cè)定吸光值，分別記為 A 測(cè)定管，A 對(duì)照管，A 標(biāo)準(zhǔn)管，A 空白管，計(jì)算?A 測(cè)定=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管；?A 標(biāo)準(zhǔn)= A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管。 | ||||
三、乳酸含量的計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，以其對(duì)應(yīng)的吸光值（?A標(biāo)準(zhǔn)）為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程
y=kx+b，將?A測(cè)定帶入公式中得到x（µmol/mL）。2、乳酸含量計(jì)算
（1） 按照蛋白含量計(jì)算
LA含量（µmol/mg prot）=x×V 樣÷V 樣÷Cpr =x÷Cpr
（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
LA含量（µmol/g 鮮重）=x×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)=x ÷W。
（3） 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
LA含量（µmol/106 cell）=x×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)=x ÷細(xì)胞數(shù)量
（4） 按照液體體積計(jì)算
LA含量（µmol/mL）= 10×x。
V樣品：加入的樣品體積，0.01mL。：W：樣本質(zhì)量，g/mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL， 蛋白濃度需自行測(cè)定； V提取液：加入的提取液體積，1mL；細(xì)胞數(shù)量，5×106個(gè)；V液體：液體樣本體積，0.1mL。
注意事項(xiàng)：
1. 若測(cè)定吸光值?A大于最大濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD值，請(qǐng)將樣品體積進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?/font>
再進(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：
實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目
| |||
| 染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
| ||
| |||
|
