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微量輔酶ⅠNAD(H)含量測(cè)定常見(jiàn)問(wèn)題
點(diǎn)擊次數(shù):2528 更新時(shí)間:2021-06-23

                                                           規(guī)格:100管/48樣

輔酶NAD(H)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

輔酶 NAD(H)Ⅰ廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要?dú)涫荏w,生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧,在合成 ATP 的同時(shí),形成大量的 ROS,同時(shí) NADH 再生為 NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過(guò)這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和TCA循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的 NAD(H)NADH/NAD+比值說(shuō)明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過(guò)氧化狀態(tài)。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外,NAD+降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測(cè)定原理

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+NADHNADH通過(guò)PMS的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT)為甲瓚,在570nm下檢測(cè)吸光值;而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH,進(jìn)一步采用MTT還原法檢測(cè)。

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

酸性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

堿性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

試劑一:液體 10 mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:液體 3 mL×1 瓶,4℃保存;

試劑三:粉劑×1 瓶,-20 ℃保存,用時(shí)加入3mL蒸餾水,混勻,用不完的試劑4℃保存一周;

試劑四:粉劑×1 瓶,4 ℃保存,用時(shí)加入3mL蒸餾水,混勻,用不完的試劑4℃保存一周;

試劑五:液體 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存;

試劑六:液體 30mL×1 瓶,4 ℃保存;

試劑七:液體 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NAD+NADH的提取

1  血清(漿)中 NAD+NADH的提取

NAD+的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為15~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL酸性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);

冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

NADH 的提取:按照血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為 15~10 的比例(建

議取約0.1mL 血清(漿),加入 1mL 堿性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2  組織中 NAD+NADH 的提取:

NAD+的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)為15~10的比例(建議取約0.1g組織,加入1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

NADH 的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(mL)為 15~10 的比例(建議取約 0.1g組織,加入 1mL 堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

3  細(xì)胞或細(xì)菌中NAD+NADH的提取:

NAD+的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):酸性提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液),超聲波破碎 1min(冰浴,強(qiáng)度20%或200W,超聲2s,停1s),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

NADH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):堿性提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL堿性提取液),超聲波破碎 1min(冰浴,強(qiáng)度 20%或 200W,超聲2s,停1s),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至570nm,蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加樣):

試劑名稱(μL)

對(duì)照管

測(cè)定管

樣本

20

20

試劑一

80

80

試劑二

30

30

試劑三

30

30

試劑四

30

30

試劑五

30

30

試劑六

200

混勻,室溫避光靜置 20min

試劑六

 

200

充分混勻,靜置 5min 后,20000g25℃離心 5min,棄上清,沉淀中加入:

試劑七

400

400

混勻,取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中,570nm下讀取對(duì)照吸光值A1和測(cè)定管吸光值 A2,計(jì)算△A=A2-A1

注意事項(xiàng)

1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對(duì)照管和測(cè)定管的測(cè)定步驟的區(qū)別:對(duì)照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測(cè)定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過(guò)程中注意避光。

4、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管,本試劑盒100管保證測(cè)48個(gè)NAD+ NADH.

NAD+NADH含量的計(jì)算

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(一)NAD+含量的計(jì)算

1、血清(漿)中 NAD+含量計(jì)算

NAD+含量(nmol/mL=[(A -0.099)×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(A -0.099

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NAD+(nmol/mg prot=[(A-0.099)×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)

=36.1×(A-0.099)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NAD+(nmol/g 鮮重)= [(A-0.099)×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)

= 72.2×(A -0.099)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NAD+(nmol/104cell=[(A -0.099)×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(A -0.099

(二)NADH 含量的計(jì)算

1、血清(漿)中NADH含量計(jì)算

NADH 含量(nmol/mL= [(A -0.065)×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(A -0.065

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADH (nmol/mg prot= [(A-0.065)×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)

= 24.7×(A -0.065)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADH (nmol/g 鮮重)= [(A -0.065)×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)

= 49.4×(A -0.065)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADH (nmol/104cell= [(A -0.065)×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)

=0.0988×(A -0.065

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mLV2:加入提取液體積,2mLV3:加入血清(漿)體積:0.1mLCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(一)NAD+含量的計(jì)算

1、血清(漿)中 NAD+含量計(jì)算

NAD+含量(nmol/mL=[ (A -0.099)×72.2×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 1444×(A -0.099

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NAD+ (nmol/mg prot=[(A-0.099)×72.2×V1)]÷(V1×Cpr)

= 72.2×(A -0.099)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NAD+ (nmol/g 鮮重)= [(A-0.099)×72.2×V1)]÷(W×V1÷V2)

= 144.4×(A -0.099)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NAD+(nmol/104cell=[(A -0.099)×72.2×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.2888×(A -0.099

(二)NADH 含量的計(jì)算

1、血清(漿)中 NADH 含量計(jì)算

NADH 含量(nmol/mL= [(A -0.065)×49.4×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 988×(A -0.065

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADH (nmol/mg prot= [(A-0.065)×49.4×V1) ]÷(V1×Cpr)

= 49.4×(A -0.065)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADH (nmol/g 鮮重)= [(A -0.065)×49.4×V1) ]÷(W×V1÷V2)

= 98.8×(A -0.065)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADH (nmol/104cell= [(A-0.065)×49.4×V1) ]÷(500×V1÷V2)

=0.1976×(A -0.065

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mLV2:加入提取液體積,2mLV3:加入血清(漿)體積:0.1mLCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

注意:最di檢測(cè)限為 1nmol/mL 或 或 1nmol/g  鮮重 或 或 0.01nmol/mg prot

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

 

免疫組化IHC染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

細(xì)胞、組織TUNEL凋亡染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

試劑盒免費(fèi)代檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

 

透射電鏡服務(wù)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡

核仁組成區(qū)嗜銀-AGNOR染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

免疫共沉淀(CHIRP)實(shí)驗(yàn)

RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)代做

酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)服務(wù)

雞傳染性法氏囊病病毒VP2抗體診斷試劑盒

喹諾酮類快速檢測(cè)試劑盒

組織芯片/微陣列定制技術(shù)服務(wù)

 

染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

 

多因子液相芯片技術(shù)(Luminex)實(shí)驗(yàn)

免疫細(xì)胞化學(xué)ICC實(shí)驗(yàn)服務(wù)

ATP/ADP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

蛋白雙向(2-D)電泳實(shí)驗(yàn)服務(wù)

蛋白相互作用分析

堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

PKC活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

非標(biāo)定量實(shí)驗(yàn)

(Label-free)

 

DIGE技術(shù)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

端粒酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

掃描電鏡服務(wù)

NF-KB p65活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

 

慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)服務(wù)

 

滬公網(wǎng)安備 31011802001676號(hào)

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