Protein A+G瓊脂糖凝膠說(shuō)明書(shū)
Protein A+G Agarose
Cat. No. K0349
保存：2-8 ℃
組分說(shuō)明
Cat.No. K0349
Volume 2 ml
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本產(chǎn)品為Protein A 和 Protein G 共價(jià)交聯(lián)到4% Agarose beads 上的產(chǎn)物，并保存在含有0.05%疊氮鈉的TBS 緩沖液中，2 ml Protein A+G Agarose 中共含有 0.5 ml Agarose beads，約2 mg 重組的Protein A+G。主要用于免疫沉(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗體的純化。適用于免疫沉淀所有Protein A Agarose 和Protein G Agarose 單獨(dú)可以免疫沉淀的抗體，包括Mouse IgG1，IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, Rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, Rabbit IgG, Rabbit and Goat polyclonal Abs，以及Human IgG1, IgG2,IgG3 和IgG4。本產(chǎn)品如果用于常規(guī)的免疫沉淀，可以免疫沉淀100 次。
注意事項(xiàng)
1. 請(qǐng)勿冷凍保存本產(chǎn)品。
2. Protein A+G Agarose 使用前一定要充分重懸，即充分顛倒若干次使混合均勻。
3. 從蛋白樣品收集開(kāi)始，所有步驟中蛋白樣品都必須在4℃或冰上操作。
4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
操作步驟
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：
1.1. 蛋白樣品的準(zhǔn)備：
1.1.1 對(duì)于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，然后加入500 μl至2 ml細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。
1.1.2. 對(duì)于組織樣品參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解。
1.1.3. 對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解。
注： 詳細(xì)的裂解方法參考不同裂解液的詳細(xì)使用方法。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過(guò)高，可以用裂解液或PBS適當(dāng)稀釋?zhuān)绻鞍讟悠窛舛冗^(guò)低，在以后的裂解過(guò)程中宜適當(dāng)減少裂解液的用量。
1.2. 去除非特異性結(jié)合(可選做)：
1.2.1. 取200 μl至1 ml蛋白樣品，蛋白量約為200 μg至1 mg，加入約1微克和免疫沉淀時(shí)使用的IgG種屬相同的普通IgG和20 μl充分重懸的Protein A+G Agarose，4℃緩慢搖動(dòng)30分鐘至2小時(shí)。
1.2.2. 2500 rpm(約1000 g)離心5分鐘，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。
注： 所謂種屬相同的IgG是指，例如后續(xù)免疫沉淀時(shí)用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無(wú)normal IgG可以加入其它不影響后續(xù)檢測(cè)的其它mouse IgG類(lèi)型的抗體。通過(guò)和normal IgG和Protein A+GAgarose的孵育，可以充分降低非特異性的結(jié)合，降低背景。
1.3. 免疫沉淀：
1.3.1. 加入0.2-2 μg用于免疫沉淀的一抗，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。
1.3.2. 再加入20 μl充分重懸的Protein A+G Agarose，4℃緩慢搖動(dòng)1-3個(gè)小時(shí)。(為方便后續(xù)的洗滌操作可以把加入充分重懸的Protein A+G Agarose的量調(diào)整為40微升。)
1.3.3. 2500 rpm(約1000 g)離心5分鐘，或瞬時(shí)高速離心，小心吸除上清，注意寧可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。
1.3.4. 用準(zhǔn)備蛋白樣品時(shí)的裂解液或PBS洗滌沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1 ml。洗滌時(shí)離心條件和吸除上清的要求同上面的步驟C3。
1.3.5. 完成最后一次洗滌后，去除上清，加入20-40 μl 1XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀，瞬時(shí)高速離心把樣品離心至管底。
1.3.6. 100℃或沸水浴處理3-5分鐘，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時(shí)不用的樣品可以-20℃保存。
2. 免疫共沉淀：
參考免疫沉淀的方法進(jìn)行，但免疫共沉淀(CO-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。
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