β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）試劑盒說明書 |
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β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）試劑盒說明書 微量法 正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義： β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷鍵水解。在植物染病或處于其他逆境條件下，可誘導細胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA 活性測定廣泛應用于植物病理和逆境生理研究。 測定原理： β-1,3-GA 水解昆布多糖，內切β-1,3-葡萄糖苷鍵，產生還原末端，通過測定還原糖生成速率來計算其酶活性。 自備儀器和用品： 可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。 試劑組成和配制： 提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入2mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存； 試劑二：液體 30mL×1 瓶，4℃保存； 粗酶液提取： 1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或 200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；12000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 2、按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL 提取液），進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。 測定步驟 1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至550nm，蒸餾水調零。 2、樣本測定（在1.5mL EP管中依次加入下列試劑）：
充分混勻，95℃水浴 5min（蓋緊，防止水分散失），流水冷卻，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中， 550nm處記錄各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸餾水稀釋后測定（計算公式乘以相應稀釋倍數），ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設一個對照管。 β-1,3-GA 活性計算： a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下 標準條件下測定回歸方程為y=0.0958x-0.0192；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。 (1) 按蛋白濃度計算 單位的定義：每mg組織蛋白每小時產生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0192)÷0.0958×V1]÷(V1×Cpr) =10.438×(ΔA +0.0192)÷Cpr (2) 按樣本鮮重計算 單位的定義：每g組織每小時產生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h/g 鮮重)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(W×V1÷V2) = 10.438×(ΔA +0.0192)÷W (3) 按細菌或細胞密度計算 單位的定義：每1萬個細菌或細胞每小時產生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h /104cell)= [( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(500×V1÷V2) =0.0208×(ΔA+0.0192) V1：加入反應體系中樣本體積，0.035mL；V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。 b.用96孔板測定的計算公式如下 標準條件下測定回歸方程為y =0.0479x-0.0192；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。 (1) 按蛋白濃度計算 單位的定義：每mg組織蛋白每小時產生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h/mg prot)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(V1×Cpr) =20.876×(ΔA +0.0192)÷Cpr (2) 按樣本鮮重計算 單位的定義：每g組織每小時產生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h/g 鮮重)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(W×V1÷V2) = 20.876×(ΔA +0.0192)÷W (3) 按細菌或細胞密度計算 單位的定義：每1萬個細菌或細胞每小時產生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h /104cell)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(500×V1÷V2) =0.0416×(ΔA+0.0192) V1：加入反應體系中樣本體積，0.035mL；V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。 |
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