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牛外周血NK細(xì)胞分離液試劑盒

Store at：：：RT 試劑盒規(guī)格：：：：3×100ml/Kit

試劑盒內(nèi)容：

全血及組織稀釋液 100ml

細(xì)胞洗滌液 100ml

試劑 B 100ml

試劑 D 100ml

試劑 E 100ml

說明書 1 份

牛外周血NK分離液試劑盒

1. 適用于各種動(dòng)物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索

2. 相關(guān)試劑及耗材

3. 注意事項(xiàng)

4. 應(yīng)用

5. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

6. 貯藏及保存期限

7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

8. NK 細(xì)胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

9. HES-TBD550 使用說明

10. 組織單細(xì)胞懸液的制備

11. 生產(chǎn)企業(yè)

12. 參考文獻(xiàn)

2. .. 注意事項(xiàng) A． 本分離液是敏光型的，在運(yùn)輸和貯藏過程中應(yīng)在 18℃-25℃避光保存，啟封后置 4℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

B． 待分離的血液、組織及細(xì)胞要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一

定在20℃水浴箱中復(fù)溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時(shí)分離效果，

且所有操作過程一定要在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

C． 由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國(guó)內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響

分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時(shí)間，摸索*的分離條件（具體分離條件

各實(shí)驗(yàn)室自定）。

D． 使用無(wú)靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。

E． *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。應(yīng)注意在血液稀釋過程中應(yīng)去除抗凝劑

體積。

 F． 分離過程中所用其他試劑如：羥乙已基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液及

紅細(xì)胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇，本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無(wú)菌、無(wú)病毒、無(wú)支原體、

低內(nèi)毒素水平且無(wú)細(xì)胞毒性，所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。

4. .. 應(yīng) 4. 用

適用于從人或各種動(dòng)物血液或臟器組織中分離 NK 細(xì)胞。

5.. . . 產(chǎn)品性能指標(biāo)

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nèi)毒素 ≤0.5...EU/ml

無(wú)菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

6.. . . 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限

18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置 4℃保存，有效期一周。

注：：：：若保證無(wú)微生物污染，啟封后可置 4℃長(zhǎng)期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時(shí)本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

7. .. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

A． 試劑

NK 細(xì)胞分離液試劑盒所含試劑、組織勻漿液、胎牛血清

B． 器材 玻璃離心管、玻璃滴管 水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)、無(wú)菌工作臺(tái)

A. 在 10ml 或 15ml 玻璃離心管中依次小心加入 B、D 兩種液體各 2ml,制成梯度界面（各液面分層一定要清晰）；

B．取 1ml新鮮抗凝血或組織單細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為2×108

-1×109個(gè)/ml，具體制備方法參照“10.組織單細(xì)胞懸液的制備”）與試劑E 1：1混合后再按2:1的比例與全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）混勻。20℃-30℃靜置20-30分鐘，吸取上層渾濁液備用，棄去大部分紅細(xì)胞；

C．將步驟B中吸取的上層渾濁液小心加于D液之液面上；

D. 以400g（約1500轉(zhuǎn)/分）離心15分鐘(半徑15cm水平轉(zhuǎn)子)；

此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為上清液層（包含血小板和血漿）。第

二層；；；；為 NK 細(xì)胞層。。。。第三層；為渾濁分離液層（含大量 T、B 及粒細(xì)胞）。第四層；為極少量紅細(xì)胞層。收集第二層 NK 細(xì)胞放入含 4-5ml 細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20 分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需 NK 細(xì)胞。

注：：：：A. 提取率約為 80%。

 B．分離大量樣品時(shí)，具體操作方法請(qǐng)參照我公司“淋巴細(xì)胞快速分離技巧”，查詢路徑：

HES 是從支鏈淀粉衍生出來的，是富含淀粉的復(fù)合物，其生理和化學(xué)特性主要由羥乙已基

取代度即取代級(jí)、平均分子量決定。大量實(shí)驗(yàn)表明平均分子量越大對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用越強(qiáng)，

有效提高紅細(xì)胞的沉降速度，從而使紅細(xì)胞與其它細(xì)胞分離。故而，使用 HES-TBD550（羥

乙基淀粉 550）沉淀法是一種高效的細(xì)胞分離方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、

骨髓基質(zhì)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的多潛能組織干細(xì)胞,是在

細(xì)胞治療、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細(xì)胞。MSCs 不僅存在于骨髓,也可從臍血、

外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離。UCB - MSCs 的分離、篩選、

增殖、分化與臍血樣本的選擇、培養(yǎng)基的差異以及分離、擴(kuò)增分化過程中操作技術(shù)等多種因

素有關(guān)。目前用于 UCB - MSCs 分離的方法有:貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀

法和免疫磁珠法。流式細(xì)胞儀法對(duì)細(xì)胞損傷較大，免疫磁珠法價(jià)格相對(duì)較貴且由于抗原抗體

反應(yīng)也容易改變細(xì)胞原有特性，而 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法常與貼壁篩選法結(jié)合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的純度，目前研究多采用此法。國(guó)內(nèi)不少學(xué)者采用羥乙已基淀粉沉淀紅細(xì)胞，然后再進(jìn)行離心分離單個(gè)核細(xì)胞，也取得不錯(cuò)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明采用隨機(jī)數(shù)字表法，將每份臍血隨機(jī)分入兩個(gè)不同處理組，從而將臍血樣本的個(gè)體差異減小到zui小程度。結(jié)果證實(shí)，HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法獲得的有核細(xì)胞數(shù)量明顯多于 FICOLL 密度梯度離心法。本實(shí)驗(yàn)采用的羥乙已基淀粉商品名為

HES-TBD550（羥乙已已基淀粉 550），克分子滲透壓為 308mosm／L，膠體滲透壓為 68／36 mmHg,可影響紅細(xì)胞集聚性沉降率。紅細(xì)胞集聚是可遞性橋接結(jié)構(gòu)形成的結(jié)果，由大的 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）分子處在紅細(xì)胞之間聯(lián)接而成。HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）同時(shí)還阻礙白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并使平均血小板容積呈現(xiàn)微弱地降低，從而有輕度抑制血小板集聚的功能。臍血經(jīng) HES-TBD550（羥乙一基淀粉 550）處理后，可使紅細(xì)胞沉積至試管底，對(duì)其它主要成分包括干細(xì)胞無(wú)影響。經(jīng)這樣處理后，實(shí)驗(yàn)時(shí)間相對(duì)較短（平均為 1.5 h），步驟相對(duì)較少，細(xì)胞污染幾率小，從而使細(xì)胞數(shù)損失減少。結(jié)論證明，與相應(yīng)的干細(xì)胞分離液聯(lián)合分離使用羥乙已基淀粉沉淀法是一種高效的臍血干細(xì)胞分離方法。

10.. . . 組織單細(xì)胞懸液的制備

注：：：：A.. .. 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法，，，，酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化 酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化

酶種類各不相同，，，，請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) 請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) 請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn)。。。。

B. .. 全過程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境 B. 全過程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境 全過程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境。。。。

剪碎法：：：：將組織塊放入平皿后，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至

勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)

(另購(gòu))過濾到試管內(nèi)；離心沉淀 1500轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細(xì)胞洗滌液清洗 3次，每次以 500rpm

短時(shí)低速離心除去細(xì)胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過濾去細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并

調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血

清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108

-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi)，加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法

胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器；收集

細(xì)胞懸液，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細(xì)胞洗滌液

洗 3 次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)

細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108

-1×109 個(gè)

/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）

進(jìn)行。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于

對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。

計(jì)數(shù)與計(jì)算過程

1）、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，

對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4）、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：

細(xì)胞密度＝（4 個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個(gè)/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：

1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

 而 1ml＝1000mm3

細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)： 細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：：：

A． 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到 2 個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)

胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個(gè)/10mm2或>500 個(gè)/10 mm2

時(shí)，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。

B． 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

C． 取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混

勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

D． 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)

胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。

E． 操作時(shí)，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤： 初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：：：

A． 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

B． 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

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